HODOWLA KOMÓREK I TKANEK

HODOWLA KOMÓREK I TKANEK

Komórki hodujemy w warunkach sterylnych tj. pod ławą laminarną otwieramy butelki i np. zmieniamy pożywkę.

Komórki inkubujemy w inkubatorze z wilgotną atmosferą i w obecności 5% CO2 – takie warunki przypominają stan w tkankach organizmu. Bez CO2, gdy np. się skończy w butli, komórki po 2-3 dniach umierają.

Standardowe pożywki do hodowli komórek to RPMI, Iscoves, Dulbecos. Uwaga: Dulbecos występuje w dwóch wersjach: high glucose: 4,5 g/l i low glucose 1 g/l – można przeczytać na etykiecie opakowania. Większość komórek potrzebuje high glucose i w low glucose nie dzieli się i umiera.

Standardowe suplementy pożywek: antybiotyk, antymycotic (AA) : roztwór antybiotyków najczęściej firmowo dostarczany jako stock (roztwór) 100x stężony i należy go rozcieńczyć 1:100, czyli do pół litra pożywki dodać 5 ml AA. Każde nowo otwarte opakowanie pożywki wzbogacamy o AA, pisząc na butelce datę otwarcia, że dodano AA, inicjały osoby która dodała. AA jest przechowywany w -20stC. Duże opakowanie rozmrażamy w łaźni wodnej, porcjujemy po 5 – 10ml, następnie znowu zamrażamy w -20stC. AA w pożywce w inkubatorze jest stabilny 3 dni w pożywce z FCS w lodówce jest stabilny przez 7 - 14 dni, w pożywce bez FCS do 2 m-cy.

FBS fetal bowine serum: płodowa surowica bydlęca jako źródło czynników wzrostu dla komórek. Nowy FBS (o ile nie ma na etykiecie napisu „Heat inactivated”) wymaga inaktywowania ciepłem, tj. podgrzania nowo otwartej butelki do temp. +56stC i inkubowania w tej temperaturze przez 30 min. Następnie należy rozporcjować po 50 ml, schłodzić i włożyć do lodówki, a do dłuższego przechowywania - zamrozić. Również podpisać inicjałami i datą butelkę lub porcje w falkonach, oraz zaznaczyć że FBS był inaktywowany. Pełna pożywka zawiera 10 % FBS. Ważne, aby to było 10% a nie 9%, gdyż niektóre komórki są na to wrażliwe i wolniej lub wcale się nie dzielą.

L-glutamina - aminokwas niezbędny do wzrostu komórek. Większość pożywek ma glutaminę. Wersją stabilną glutaminy jest glutamax. Jeśli pożywka ma L-glutaminę ale jest przeterminowana, zwłaszcza sporo, warto dodać L-glutaminę. Nadmiar nie zaszkodzi, a niedobór zatrzyma wzrost komórek. L-glutamina w stocku jest 100x, tak jak AA.

Jak powinien wyglądać opis butelki z pożywką: data otwarcia i co do niej dodano, inicjały osoby która dodaje. Nie robimy na raz pół litra pełnej pożywki z FBS, tylko przygotowujemy porcje po 50-100 ml, gdyż taka pożywka ma ograniczoną trwałość.

Pożywka standardowa ma dodany barwnik – fenol red. Jest to indykator pH. Jeśli komórki się przegęszczą i pożywka się zakwasi, staje się pomarańczowa, jeśli stanie się żółta jak siuśki, komórki prawdopodobnie już umarły albo zaczynają umierać, jeśli pożywka nie zmienia koloru – komórki albo nie dzielą się wcale albo umarły, albo mają zahamowanie kontaktowe w przypadku linii pierwotnych. Jeśli pożywka jest znacznie różowa, może to świadczyć o infekcji grzybiczej lub braku CO2 w inkubatorze.

Komórki dzielimy na nie adherentne, rosną w zawiesinie, np. komórki białaczkowe lub komórki adherentne, które tworzą połączenia z dnem naczynia hodowlanego. Naczynia szklane mają ujemny ładunek powierzchni i na nich przylegają komórki adherentne. Plastiki muszą mieć specjalną powierzchnię i są opisane tissue culture lub treated. Warunkiem przeżycia komórek adherentnych jest przyleganie do dna, więc jak komórki się przegęszczą i odkleją to są prawdopodobnie martwe.

Przesiewanie komórek: to redukcja ich liczby, aby nie były za gęste. Przesiewamy w zależności od linii kom. 2-3x w tygodniu 1:5 lub 1:10. Komórki nie adherentne wirujemy np. 1 ml z 5 ml, po czym wyrzucamy pożywkę znad komórek i dodajemy 5 ml świeżej – właśnie zostały przesiane 1:5.

Komórki adherentne wymagają trypsynizacji. Najpierw zlewamy pożywkę, przepłukujemy butelkę 5 ml PBS bez Ca/Mg, dodajemy 1 ml trypsyny, czekamy ok. 1 minuty, zlewamy trypsynę, można jeszcze chwilę poczekać, aż będzie widać, że komórki zaczynają spływać. Kontrolujemy pod mikroskopem uprzednio zamknąwszy butelkę, czy komórki się odkleiły. Zawieszamy komórki w 5 ml świeżej pożywki, dobrze rozpipetowujemy, aby nie było zlepków, po czym 4 ml wyrzucamy a do 1 ml dodajemy 4 ml nowej pożywki. Właśnie zostały przesiane 1:5.

Plastiki do hodowli. Hodujemy zazwyczaj komórki w małych butelkach o powierzchni dna 25 cm2 w objętości 4-5 ml pożywki. Butelka musi zawierać napis - jaka to linia komórkowa, datę założenia, inicjały hodowcy, ewentualnie numer pasażu. Szyjka i korek butelki to miejsca szczególnie narażone na zakażenie. Należy butelki przenosić lekko przechylone, aby korek się nie zalewał pożywką. Jeśli butelka ma filtr w korku, nie trzeba jej odkręcać, jeśli korek jest lity, to w inkubatorze trzeba ją lekko odkręcić aby był dopływ CO2.

Inne naczynia hodowlane np. szalki Petriego, płytki - dodajemy tyle pożywki, aby komórki były przykryte. Zazwyczaj 4-5 ml na każde 25cm2 powierzchni. Powierzchnia jest napisana na opakowaniu zbiorczym, można też sprawdzić w katalogu.

Pipety serologiczne i pasterówki: służą do przenoszenia płynu między butelkami i są sterylnie zapakowane. Pipety otwieramy trzymając lewą ręką za papier a prawą odrywając folię. Lewa ręka łapie pipetę przez opakowanie a prawa nakłada na górny brzeg pipetor. Zsuwamy lewą ręką opakowanie i sterylną pipetą nie dotykamy niczego pod laminarem oprócz wnętrza jałowych butelek. Pasterówki rozrywamy u góry i delikatnie wyjmujemy. Unikamy manewrowania rękawem lub ręką nad otwartymi cieczami jałowymi – możliwość kontaminacji.

Jeden zestaw pipet służy do jednej linii komórkowej. Przy pracy z inną linią bierzemy świeże pipety bo inaczej ryzyko pomieszania komórek innych linii. Nie do uratowania-  jedną i druga hodowlę trzeba wtedy wyrzucić.

UWAGA: W miarę możliwości oszczędzamy plastiki. Są bardzo drogie - około 1 PLN za pipetę, naczynie, etc. Pożywka 50 zł, FBS kilkaset złotych.

Taniej i lepiej jest zamrozić komórki niż je hodować w nieskończoność planując dłuższą przerwę w eksperymentach.

Mrożenie komórek: planując przerwę w eksperymentach, można komórki zamrozić. Mrozimy komórki z jednej małej pełnej butelki (25cm2) na jedną kriotubkę. Najpierw uzyskujemy zawiesinę komórek i wirujemy je 1200 rpm, 5 minut. Odciągamy pożywkę, zalewamy 1 ml Freezing Medium (90% FBS + nie więcej jak 10% DMSO).  Umieszczamy w kriotubce, zamykamy i 3-5 minut czekamy, aż DMSO przepoi komórki, następnie wkładamy do -70stC. Jeśli to możliwe w specjalnym pojemniku do mrożenia z izopropanolem.

W -70stC komórki mogą być przechowywane przez 3 miesiące, potem powinny być przeniesione do ciekłego azotu. Na kriotubce piszemy obowiązkowo: nazwę linii komórkowej, datę mrożenia i inicjały mrożącego, można też napisać nazwę medium hodowlanego.

Rozmrażanie komórek: Przygotować wcześniej laminar, pożywkę i naczynia na komórki. Kriotubkę ogrzać najlepiej trzymając w ręku w rękawiczce aż będzie płynna i szybko zawiesić w 5 ml pełnej pożywki, odwirować 1200 rpm 5 minut, zawiesić w świeżej pożywce, umieścić w butelce i podpisać.  DMSO 10% jest toksyczne dlatego czas od rozmrożenia do przeniesienia do pożywki powinien być krótki ok. 5 min.

Trypsynizacja: odciągnąć pożywkę, zawsze komórki trzeba przepłukać PBS bez Ca/Mg – gdyż FCS w pożywce inaktywuje trypsynę i nie zadziała. Trypsyna powinna być ciepła. Nie trzymamy za długo w trypsynie tyle ile to niezbędne. Jeśli zawieszamy w PBS to warto dodać trochę pełnej pożywki (1ml/10ml) albo parę kropli FCS aby przerwać działanie trypsyny. Czasem komórki nie chcą się odklejać, wtedy należy zlać trypsynę i dodać świeżej a nie przedłużać czasu trypsynizacji. 5 minut w trypsynie do długo a 20 minut to bardzo długo i może uszkodzić komórki.

Praca pod laminarem:  Laminar włączyć 5-10 min przed początkiem pracy aby powietrze było jałowe, przetrzeć  powierzchnię roboczą  70%  etanolem.  UWAGA 10 cm od brzegu laminara jest strefą nie jałową, pracujemy najgłębiej jak się da, aby uniknąć kontaminacji. Pracujemy w rękawiczkach i spryskujemy je 70% etanolem. Przewidujemy każdy następny ruch. Najpierw odkręcamy butelkę z pożywką potem butelkę hodowlaną a dopiero wtedy otwieramy pipetę i naciągamy pożywkę. Do otwierania naczyń pod laminarem potrzebujemy dwóch rąk aby zapewnić jałowość pracy. Jak mam w ręku nabity pipetor – nie mogę go już odstawić bez ryzyka kontaminacji – wszystkie potrzebne naczynia powinny być już otwarte.

Porządek pod laminarem to podstawa. Przed pracą upewnij się, że nie zostały po kimś niepotrzebne rzeczy, a jeśli zostały, wystaw je, uprzednio zamykając butelki albo poproś poprzednika o ich usunięcie.  Butelki stawiamy przy ścianie aby na środku było miejsce na manewrowanie pipetą i butelkami z komórkami. Niepotrzebną już trypsynę, PBS zakręć. Trzymaj odkręcone butelki najkrócej jak to możliwe. Zaczynając pracę upewnij się, czy wszystko co potrzeba, masz wyjęte. Jeśli musisz wstać i coś przynieść, po powrocie spryskaj ręce etanolem.  Zużyte plastiki wyrzucamy do kosza - powinien być przy laminarze bez potrzeby wstawania. Zużyte ciecze wylewamy do pojemnika na odpady, jest to najczęściej zlewka lub moczówka stojąca przy zlewie, trzeba ja na początku pracy spryskać etanolem i wstawić pod ławę. Po pracy trzeba ciecze wylać do zlewu a zlewkę przepłukać wodą i odstawić do wyschnięcia. Lege artis wszystkie ciecze powinny być odciągane ssakiem z jałowymi końcówkami, a nie wylewane do otwartych naczyń – chwilowo ssaków brak.

Nie wyrzucamy pipety z pożywką wprost do kosza, tylko zlewamy pożywkę do przygotowanego naczynka. Uwaga naczynie na zlewki jest nie jałowe jak dotknie go pipeta, trzeba ją wyrzucić.

Po pracy sprzątamy po sobie wszystko, wyrzucamy niepotrzebne opakowania wylewamy ciecze, chowamy komórki do inkubatora, następnie spryskujemy etanolem i przecieramy laminar kawałkami ligniny. Jeśli skończy się lignina pocięta, należy nożyczkami przyciąć z dużych arkuszy ligniny. Przycinamy trochę więcej niż nam potrzeba, myśląc o innych J.

Jeśli z opakowania zbiorczego zużywamy np. ostatnią butelkę,  należy przynieść nowe opakowanie, jeśli zostało już jedno -2 opakowania proszę zgłosić to osobie odpowiedzialnej za zamówienia, ewentualnie opiekunowi.

To samo dotyczy wszystkich odczynników, ostatniej butelki z pożywką, antybiotykiem, trypsyną etc. Jak nie ma komu, można napisać na kartce co się kończy i zostawić w widocznym miejscu.

W laboratorium wszystkie próbki, naczynia, pożywki, odczynniki MUSZĄ być podpisane: data, inicjały osoby która się nimi zajmuje, co jest w środku. Nie popisane naczynia będą wyrzucane. Nie ma tłumaczenia że akurat zginął flamaster albo się spieszymy. Podpisywanie jest równie ważne jak sam eksperyment.

Jeśli opisujemy próbki komórek np. na western blot to na małych eppendorfówkach jest mało miejsca. Opis powinien zawierać datę i kod próbki a w waszym zeszycie laboratoryjnym pod tą datą powinno być opisane co to jest, jak było traktowane i warunki całego eksperymentu.

Dziennik laboratoryjny: Jest równie ważny, jak wasza praca tu. Każdy eksperyment powinien być opisany w ten sposób, żeby ktoś drugi mógł go powtórzyć. Jeśli jest to ten sam schemat exp jak miesiąc temu, podajemy odnośnik do strony w zeszycie gdzie jest to DOKŁADNIE opisane. Rozmrażanie komórek powinno być odnotowane w zeszycie, zamrażanie powinno być  odnotowane z zapisaniem w jakim pojemniku na której półce jest kriotubka. Szukanie przez 30 minut gdzie jest włożona, grozi rozmrożeniem wszystkich komórek w pojemniku albo podwyższeniem ich temperatury co może całą partię komórek znacznie uszkodzić.

Podpisując zrobiony przez nas roztwór, podajemy jego skład.

Strona z kursem on-line dt. hodowli komórek:

http://www.inflammation.ndo.co.uk/Cell%20Culture/3i%20Lecture%20Notes/Module1.html

Tekst opracowała Izabela Młynarczuk-Biały